Science重要发现丨终于找到了丝氨酸转运进入线粒体的关键因子

撰文丨初心

责编丨迦溆

一碳单位代谢中，生成一个一碳单位的过程会合成许多重要的代谢产物，包括所周知的生命关键分子核苷酸、氨基酸、脂类【1-3】。这个途径分为胞质和线粒体两个分支，其中一个关键的步骤，是丝氨酸如何进入线粒体。

在哺乳动物的细胞分裂过程中，线粒体通过对丝氨酸的分解代谢，供应了生物合成所需的绝大部分一碳单位（图1）【4-7】。而事实上,许多癌细胞正是依靠丝氨酸代谢产生的一碳单位进行增殖,并且在肿瘤细胞中，线粒体内丝氨酸的相关分解代谢酶通常被上调。由此可见，丝氨酸如何进入线粒体是一碳单位产生的如此关键的步骤,并具有如此重要的生理意义，但是, 此前人们对丝氨酸如何转运进入线粒体的机制竟一无所知【4, 8-10】。

图1. 一碳单位在线粒体内的代谢

近日，来自怀特黑德生物医学研究所的David M. Sabatini研究组，在Science杂志上以长文形式发表了题为SFXN1 is a mitochondrial serine transporter required for one-carbon metabolism的论文（http://science.sciencemag.org/content/362/6416/eaat9528），论文中首次发现了丝氨酸进入线粒体的重要转运蛋白SFXN1。

线粒体一碳单位代谢通路的基因筛选得到SFNX1

为了寻找丝氨酸的转运蛋白，Sabatini研究组很巧妙地设计了一个CRISPR-CAS9介导的基因筛选方法，该方法的原理基于线粒体丝氨酸转运的缺失会降低细胞的增殖速度。即便丝氨酸的运输有可能存在冗余机制，只需要简单地通过去除培养基里的外源丝氨酸就能抑制胞内丝氨酸浓度。因此，他们通过用缺乏丝氨酸的培养基来筛选可能的丝氨酸转运蛋白基因。

为了实现这个筛选实验，他们选择首先生成两个细胞系，人类Jurkat白血病T细胞和K562红细胞性白血病细胞，并在这两个细胞系中敲除丝氨酸羟甲基转移酶1（hydroxy methyltransferase 1，SHMT1)，SHMT1是线粒体SHMT2的同工酶，SHMT2在胞质一碳通路中丝氨酸和甘氨酸互相转换中起重要作用（图 2A）。选择这两种细胞系是因为它们适于筛选，并且线粒体一碳单位通路的活性很高 【6, 11】。

图2 代谢基因筛选

该研究用慢病毒做sgRNA文库的载体，感染前面提到的两种SHMT1-null细胞。sgRNA文库中共有约3000个代谢酶、小分子转运蛋白和代谢相关转录因子（~10 sgRNAs/基因），同时也包含499个对照sgRNAs。感染后的细胞用RPMI完全培养基或不含丝氨酸的RPMI培养基进行培养，然后通过深度测序比较两种培养条件下sgRNA的丰度。差异基因的分值是不添加丝氨酸相对完全培养基的sgRNA丰度分值。和丝氨酸转运相关密切的基因，细胞增殖会受到影响，因此基因丰度会明显降低，反之则变化不大。

该代谢基因文库中大多数基因的表现包括对照sgRNA都和预期相符。值得注意的是，唯一一个未知基因的分子功能得分差异差异在两个细胞系中都很明显，它就是线粒体跨膜蛋白sideroflexin 1（SFXN1）（图2C,D）。

SFXN1最初被确定为在小鼠中突变会导致贫血和轴向骨骼异常突变，它属于真核生物中保守的Sideroflex1蛋白质家族的成员【12, 13】。在人体中，SFXN1在血液、肝脏和肾脏组织中高度表达，这些组织都是一碳代谢活动较高的场所。

锁定了SFNX1之后，围绕这一基因做了一系列的验证实验，结果表明SFNX1是线粒体上丝氨酸的转运蛋白。首先用CRISPR-CAS9技术生成缺失SFNX1的细胞，并得到单克隆。然后分析细细胞的增殖与代谢物，并与已知的一碳代谢基因突变体SHMT1，SHMT2和MTHFD2相比较。证实了SFNX1是线粒体一碳单位通路的重要组成部分，SFNX1的缺失使细胞更依赖于这一通路的胞质分支路径。

通过共聚焦显微镜和STED超分辨率显微镜观察SFNX1和它的同源蛋白的定位，显示它定位在线粒体内膜（下图）。体外转运实验和分离出来的线粒体的摄取实验证实了SFNX1是一个线粒体上的丝氨酸转运蛋白。体外实验表明，SFNX1同时还参与一些结构相关的氨基酸如丙氨酸，半胱氨酸和甘氨酸的转运，可能还参与少量的其它小分子代谢物的转运。

对于SFNX1的冗余基因分析，SFNX3是相似性最高的同源基因（88%蛋白序列相似性），同时敲除这两个基因的细胞在缺甘氨酸的细胞中完全不能增殖。而同时敲除SFNX1， SFNX2和SFNX3的细胞则根本不能存活。同源基因的回补可以逆转这种缺陷型表型，表明冗余基因的存在。除了SFNX4，过表达SFNX家族的任意一个基因都能逆转这种缺陷型表型，甚至果蝇中的同源基因也能部分这种逆转缺陷型表型。

SFNX1在许多癌细胞中都有表达，其中白血病和淋巴瘤中表达量最高。因此，SFNX1及其同源蛋白可能是调节丝氨酸在细胞内命运的重要节点，同时也很可能在肿瘤细胞生长中扮演着重要角色。

David M. Sabatini

作为麻省理工学院（MIT）和怀特黑德研究所的一员，David M. Sabatini因为发现了雷帕霉素的靶点蛋白质（mTOR）及其信号通路而声名鹊起。mTOR通路在细胞代谢、生长和扩散中起着的中心调控分子的作用。因为mTOR通路在许多细胞过程被激活,并在衰老和疾病进程中被抑制，例如癌症、癫痫、和糖尿病，他的研究引起了广泛的兴趣。

David M. Sabatini研究组研究兴趣集中在哺乳动物的生长和新陈代谢的调控上。他们的工作一部分集中mTOR通路上，他们已经鉴定定了很多参与mTOR通路的蛋白质分子，并在细胞和生理水平阐述了它们的功能；另一部分兴趣还集中在肿瘤发生相关的其它代谢基因上。此次发现的线粒体丝氨酸转运蛋白SFNX1是他们的又一重大发现。

参考文献

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13. G. Miotto, S. Tessaro, G. A. Rotta, D. Bonatto, In silico analyses of Fsf1 sequences, a new group of fungal proteins orthologous to the metazoan sideroblastic anemia-related sideroflexin family. Fungal Genet. Biol. 44, 740–753 (2007).

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